免疫检查点分子跟人脑胶质瘤

一、脑组织的免疫学基础

由于血脑屏障(the blood-brain barrier，BBB)的存在、抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APCs)的缺乏以及神经细胞和胶质细胞不表达主要组织相容复合物(major histocompatibility complex，MHC)，传统观念认为大脑是一个免疫豁免器官，因此免疫治疗在胶质瘤中的应用起初并未引起人们的关注。然而后续关于脑脓肿、实验性脑脊髓灰质炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)以及肿瘤的研究中发现，免疫细胞可以透过血脑屏障抵达病灶区。

研究表明，血脑屏障主要通过血管内皮细胞、基膜、胶质细胞终足的特殊结构和生物化学特性选择性的控制中枢神经系统内环境稳态，但在病理状态下血脑屏障却会遭到破坏，引起微血管通透性增加，血管性水肿，胶质细胞终足水肿，从而更加有利于免疫细胞的转移。最新研究发现，和其他组织类似，脑也能通过脑膜淋巴管来与外周免疫系统相连。进一步的研究发现血管内皮细胞、胶质细胞以及血管周围的巨噬细胞和平滑肌细胞在一定程度上也具有抗原提呈能力，从而协助颅内免疫反应的发生。上述研究表明，大脑并不是免疫豁免器官，尤其是在病理状态下，免疫系统不仅可以进入脑组织，而且能发挥与在外周相似的免疫反应。

这些基础研究不仅改变了人们对于大脑与机体免疫系统的传统观念，同时也为胶质瘤免疫检查点靶向治疗提供了理论基础。尽管当前对免疫检查点抑制剂在胶质瘤中的研究还相对较少，但是随着研究的深入，相信免疫检查点抑制剂在胶质瘤的治疗中必然会获得广阔的应用前景。

二、免疫检查点分子

早期肿瘤疫苗失败的原因之一是无法充分有效的激活T细胞活性，到80年代后期研究者们才逐渐认识到单纯的依靠肽/MHC复合物与T细胞受体结合(T cell receptor，TCR)并不能使T细胞充分活化。T细胞抑制性通路在T细胞活化的同时也同样被激活，而在这个过程中细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)起着关键性的作用，而随着CTLA-4走进研究者的视野，从此开启了免疫检查点在肿瘤治疗研究的新纪元。T细胞活化首先要将抗原提呈给T细胞受体，然后由共刺激分子和共抑制信号分子作为第二信使共同参与调节T细胞免疫反应，并决定T细胞反应的持续时间和强度，而这些抑制性信号即为免疫检查点分子。

人脑胶质瘤和其它肿瘤类似，可以形成免疫抑制性的肿瘤微环境，从而利用免疫检查点抑制通路来抑制T细胞抗肿瘤反应。免疫检查点抑制剂就是以单克隆抗体抑制剂的形式来阻断这些抑制性信号通路，激活全身免疫、增强T细胞活性，从而抑制肿瘤生长，最终达到消灭肿瘤的目的。

(一)CTLA-4

CTLA-4是一种目前受到广泛关注的免疫检查点，其研究也相对较为成熟，为一种与CD28同源的跨膜糖蛋白，胞内段含有一个免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)，通常表达在幼稚淋巴细胞上，可与激活受体CD28竞争相同配体B7-1(CD80)和B7-2(CD86)，且比前者更具亲和力，从而抑制免疫细胞活化和增殖，防止自身免疫性疾病发生，研究表明在CTLA-4基因敲除的小鼠中会患有一种急性致死性的淋巴结病。机理研究揭示CTLA-4抗肿瘤活性增加与CD4、CD8效应细胞和FoxP3+调节性T细胞的比率相关联。此外CTLA-4的还能协同经肿瘤细胞工程学改造表达细胞因子GM-CSF的肿瘤疫苗来根除肿瘤。

2011年，美国食品药品管理局和欧洲药品管理局批准了易普利姆玛作为不能手术切除或转移性黑色素瘤的治疗药物，它是一种完全人源化的抗CTLA-4单克隆抗体，并且在多种肿瘤研究中显示出具有显著临床获益，这些肿瘤包括黑色素瘤，肾细胞癌、前列腺癌、膀胱癌和卵巢癌。早期研究发现，通过封闭CTLA-4，能使胶质瘤小鼠中诱导改变的CD4+T细胞发生逆转，并且增强抗肿瘤免疫反应，且这些获益是通过抑制调节性T细胞(regulatory cells，Tregs)免疫抑制作用获得的，而非直接作用于调节性T细胞。在Wainwright等开展的一项关于胶质瘤的研究中，利用胶质瘤小鼠模型(GL261)设置对照组和实验组，发现对照组小鼠中位生存期为29d，而使用CTLA-4单克隆抗体治疗后的小鼠，有40%小鼠超过90后仍然能存活。显然，通过靶向封闭CTLA-4介导的免疫抑制性信号通路极大地提升了胶质瘤小鼠的生存时间，其他相关研究也同时证实了这一观点。最新临床研究表明易普利姆玛与贝伐单抗治疗胶质瘤有效且毒副作用在可控范围。

(二)PD-1/PDL-1

PD-1与CTLA-4同属于抑制性免疫检点分子，其配体有PDL-1(B7-H1)和PDL-2(B7-DC)。PD-1信号通路的活化会抑制IFN-γ，IL-2和TNF-α的合成，增加IL-10的生成。随着这些细胞因子环境的改变，不仅抑制淋巴细胞的活性，同时也诱导无反应性和抗原特异性T淋巴细胞的细胞凋亡。众所周知，PDL-1可表达在肿瘤细胞表面，可引起肿瘤微环境改变从而抑制抗肿瘤免疫反应。在胶质瘤的研究中发现肿瘤细胞表面PDL-1的表达与PTEN缺乏和PI3(k)-Akt通路过度活化有关，当敲除PD-1基因则会导致自身免疫耐受的缺失，从而引起局部或全身性自身免疫疾病。这些研究都证实了PD-1可以发挥重要的负性免疫调控功能。当前FDA批准用于临床抗肿瘤治疗的抗PD-1药物有Nivolumab和Pembrolizumab，这些新型抗肿瘤药物在用于治疗黑色素瘤、直肠癌、非小细胞肺癌以及膀胱癌时都取得了不错的效果。

研究者们最初认为只有在肿瘤细胞PDL-1阳性表达的患者，才有可能从抗PD-1单抗治疗中获益。然而在随后的研究中发现，抗PD-1抗体治疗PDL-1阴性肿瘤也存在反应，只是在PDL-1阳性表达的肿瘤中反应率更高。因此，PDL-1的阳性表达和抗肿瘤治疗反应存在高度相关性，但这并不意味着PDL-1表达阴性的肿瘤患者没有疗效。一项针对转移性黑色素瘤患者抗PD-1治疗研究中也发现，在各组治疗中PDL-1阳性表达的患者中位生存期最高，但是应用抗PD-1药物治疗的各组其生存获益都要高于传统化疗组。在胶质瘤中，PD-1和PDL-1最早发现于胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)中，这为PD-1作为脑肿瘤免疫检查点靶向治疗的靶点提供了可能。

最新研究发现，PD-1在各级胶质瘤中都有表达，且其表达水平和胶质瘤WHO分级相关，Ⅳ级胶质瘤表达水平最高，然而PDL-1的表达仅局限于Ⅳ级胶质瘤，且表达水平与PD-1的表达相关联。另有研究表发现PD-1/B7H1通路的阻断可促进小鼠NK细胞杀死GL261胶质瘤干细胞，结果表明PD-1的阻断促进NK细胞杀伤GBM，是一个可行的免疫治疗策略。虽然PD-1在胶质瘤中的研究才刚刚起步，但是随着研究的深入，相信免疫检查靶向治疗在脑肿瘤治疗领域必将有所作为。

(三)CEACAM1

癌胚抗原相关细胞黏附分子1(carcino-embryonic antigen related cellular adhesion molecule 1，CEACAM1)有两个亚型，分别是CEACAM1-L和CEACAM1-S，CEACAM1-L胞内段含两个ITIM，T细胞活化时引起CEACAM1-L丝氨酸残基磷酸化，并促使其转移到T细胞膜表面，CEACAM1-L单体通过氨基末端的免疫球蛋白区域与肿瘤或免疫细胞膜表面CEACAM1单体相连，从而参与抑制性信号的转导，主要表现为抑制T细胞活化，减少IFN-γ、IL-4和IL-2等细胞因子的分泌。新近研究发现TIM-3是CEACAM1的一种异源二聚体，二者相互作用能介导T细胞免疫耐受，抑制T细胞功能。

CEACAM1作为重要的免疫检查点分子之一，在关于黑色素瘤的最新研究发现SOX9在转录水平间接调控CEACAM1的表达，敲除SOX9能使CEACAM1表达水平增高，从而使肿瘤细逃避T细胞介导的免疫杀伤，因此，通过封闭CEACAM1介导的抑制性信号通路，可以增强T细胞抗肿瘤效应。相关研究中发现应用MRG1(一种鼠科抗CEACAM1单克隆抗体)治疗黑色素瘤小鼠时能显著增强T细胞抗肿瘤效应，且不同于其他免疫调节方式，其主要在肿瘤细胞和迟发型效应淋巴细胞间相互作用，因此研究者认为是一种安全有效的治疗手段。而在近期开展的非小细胞肺癌的研究中发现，CEACAM1作为主要的免疫检查点分子之一在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用，研究者认为通过封闭该免疫检查点分子能增强细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer，CIK)的疗效，从而为非小细胞肺癌找到了治疗途径。CEACAM1在肿瘤的新生血管生成、细胞增殖、侵袭迁移中的研究已较为深入，但是作为新的免疫检查点分子在肿瘤免疫研究中鲜见报道，相信在以后的研究中会逐渐获得研究者们的青睐。

(四)其他免疫检查点的探索研究

淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3，LAG-3)表达在激活的T细胞和自然杀伤细胞上，是抑制性免疫检查点分子，同时可促进Tregs发挥免疫抑制功能以及诱导树突状细胞合成IL-12和TNF。在小鼠肿瘤模型中，通过应用抗LAG-3单抗可抑制Tregs免疫抑制功能，同时增强CD8+T细胞增殖能力，抑制肿瘤生长。T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3，TIM-3)与配体半乳凝素9(galectin-9，Gal-9)结合，可诱导效应淋巴细胞凋亡，TIM-3和PD-1在T细胞共表达可能预示着T细胞严重耗竭。在肿瘤动物模型中发现通过靶向阻断这两种免疫检查点分子可抑制肿瘤增殖，同时明显其延长生存期。吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine2，3-dioxygenase，IDO)是一种色氨酸代谢酶，在抑制抗肿瘤免疫应答中发挥关键作用，研究发现脑肿瘤细胞也能表达IDO，且同样发挥着负性免疫调控的作用。最新的研究表明CD200在多种脑肿瘤中都有表达，而GBM患者血清CD200浓度表达量最高，且和骨髓来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)扩增显著相关，他们认为中枢神经系统肿瘤可以通过CD200参与逃避免疫监视，而阻断CD200能增强抗肿瘤效应。

三、联合多种免疫检查点分子治疗肿瘤

肿瘤免疫治疗的机制目前仍令研究者们感到困惑，而对单一靶点进行治疗可能无法根治肿瘤。Sharma和Allison认为抗CTLA-4抗体虽然可以被用来通过增加T细胞数量以及IFN-γ生成来驱动T细胞抗肿瘤反应，但另一方面，这也会诱导肿瘤微环境PDL-1的表达，继而出现新的抑制性通路抑制T细胞抗肿瘤免疫反应。研究表明，抗CTLA-4(Ipilimumab)联合抗PD-1(Nivolumab)治疗PDL-1表达阴性的转移性黑色素瘤和PDL-1阳性表达的患者其疗效相似，而且相对较为安全并能迅速而持久的抑制肿瘤生长，同时可明显延长晚期黑色素瘤患者的生存时间。以上研究结果表明在肿瘤免疫治疗过程中是各种生物标记物是动态变化的，因此联合多种免疫检查点抑制剂可能给患者带来更好的收益。

相关的研究也证明抗肿瘤疫苗联合抗两种免疫检查点抑制剂(抗CTLA-4单抗、抗PD-1单抗)在B16黑色素瘤模型中的治疗有效率要显著高于抗肿瘤疫苗单独联合其中一种免疫检查点抑制剂。三联免疫疗法抗IDO联合抗CTLA-4以及抗PD-L1在小鼠脑肿瘤模型中获得了显著疗效。在抗PD-1联合抗LAG-3以及抗PD-1联合抗TIM-3的的肿瘤试验中也取得了不错的疗效。

四、小结与展望

随着免疫检查点分子在肿瘤免疫研究中的逐渐深入，肿瘤免疫检查点靶向治疗也得到了广泛的认可，Ipilimumab、Nivolumab和Pembrolizumab在治疗其他肿瘤中也得到较为广泛的开展。最新的免疫检查点抑制剂，如抗TIM-3、BMS-986016(抗LAG-3)、BMS-663513(抗-41BB)等研究也在如火如荼的进行当中。虽然目前免疫检查点抑制剂在胶质瘤中的研究仍然仍处于起步阶段，但却为胶质瘤的免疫治疗带来了新的曙光，相信后续的基础研究和大规模临床试验会逐渐显现出免疫检查点抑制剂在胶质瘤治疗中应用价值。